【引言】

VEGF受體2（VEGFR2）信號轉導在實體瘤血管生成和轉移中的重要作用促使人們開發出具有最小旁觀者效應的抑制劑。近年來，Adnectin-C在腫瘤治療中引起了廣泛的關注。

【成果介紹】

為了克服Adnectin存在的問題，本文設計了一種新型的Adnectin C，將其融合到含有Pro/Ala/Ser（PAS）重復殘基的可生物降解多肽中。用標準方法比較大腸桿菌表達的重組融合蛋白和未融合蛋白的生物活性、理化性質和藥代動力學特性。使用Linseis STA PT1600熱分析儀器進行DSC和TG實驗。動態光散射（DLS）分析表明，磷酸化Adnectin C的粒徑增加了約2倍，凈電荷略有變化。此外，PAS序列的融合提高了其抗熱誘導聚集形式生長的穩定性。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和表面等離子體共振實驗分別證實了酶聯蛋白C的高受體結合和改進的結合動力學參數。藥代動力學研究顯示，單次靜脈注射給雌性BALB/C小鼠后，Adnectin C-PAS#1（200）的最終半衰期顯著增加了4.57倍。結果表明，磷酸化可以作為開發Adnectin衍生藥物的一種更好的給藥策略，提高患者的依從性。

【圖文導讀】

圖1：純化重組蛋白的蛋白印跡分析和15%SDS-PAGE：純化Adnectin C的電泳遷移率。Lane 1：蛋白質標記，Lane 2，3：純化蛋白的洗脫1和2（純化蛋白分別為0.2mg/ml）；（a右）純化連接蛋白C-PAS#1（200）的電泳遷移率。一道：蛋白質標記；第二道至第四道：純化蛋白質的洗脫2-4（分別為0.1、0.3和1mg/ml純化蛋白）。Western-blot分析鑒定出：（b 左）Adnectin C；（b右）Adnectin C-PAS 1（200）的特定鍵。箭頭顯示產品預期尺寸的范圍。完整長度的印跡和凝膠如補充圖S2-S4所示。

圖2：流體動力學半徑和質譜表征。（a）Adnectin C主峰在96.35nm處；（b）Adnectin C-PAS#1（200），主峰在192.3nm。MALDITOF/TOF波譜顯示，Adnectin c的分子量為11374.4160Da；Adnectin c-PAS#1（200）為28076.5703Da。完整的MALDI/TOF質譜在補充圖S5中給出。

圖3：（a） 7 cm IPG條帶上磷酸化Adnectin C和天然蛋白的IEF。兩種蛋白質在pI=6.5-6.8時具有相似的凈電荷。1道為標記，2道為Adnectin C-PAS 1（200），3道為Adnectin C。Zeta電位分布曲線為：（b）Adnectin C；（c）Adnectin C-PAS 1（200）。測量顯示，Adnectin C-PAS#1（200）（-5.28mV）和天然蛋白（?6.15mV）之間的zeta電位差異可以忽略不計。

圖4：不同溫度和凍融條件下蛋白質聚集性的熱分析和評價：（a）DSC熱圖；（b）雙態去折疊酶解結合蛋白C和天然蛋白的TG曲線。樣品在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中制備，并以2°C/min的升溫速率在惰性氣氛中進行分析。在兩個溫度圖中，觀察到相對于天然蛋白的Pasylized Adnectin C和天然蛋白質的可忽略的變化；（c）在規定的溫度和孵育時間下，PASylated Adnectin C和天然蛋白質聚集。加熱后A340nm的大幅度增加表明熱穩定性降低。數據表示為平均值±標準差（三個重復）。重組蛋白（<0.01）的聚集性（<0.01）和重組蛋白（<0.01）。觀察到：（d）天然蛋白（96.35nm-733.7nm）和（e）磷酸化蛋白（192.3-266.6nm）的峰位移。觀察到低聚集形式的磷酸化。

圖5：酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）與rhVEGFR2的結合。數據表示為平均值±標準差（三個重復）。PASylated Adnectin在低于天然蛋白的濃度下達到飽和。

圖6：.Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）對培養的HUVECs的毒性評估（a），重組蛋白對VEGF誘導的HUVECs增殖的抑制作用（b），以及Adnectin C-PAS 1（200）（C）作用機制的示意圖。Te數據表示為平均值±SD（三個重復）。星號顯示樣本的存活率與VEGF組相比有顯著性差異（****p<0.0001）。

圖7：Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）抑制VEGF誘導的HUVECs遷移：（a）重組蛋白抑制VEGF誘導的HUVECs通過跨孔膜的遷移。Te數據表示為平均值±SD（三個重復）；#表示與VEGF組（陽性對照）有顯著差異（p<0.0001）。星號表示與未處理（陰性）對照組的顯著差異（**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）；（b）染色膜的代表性照片表明，與對照組相比，這兩種蛋白質顯著抑制了HUVEC的遷移（見補充圖S6中的原始照片）。

圖8：BALB/C小鼠5mg/kg給藥后Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）的藥代動力學研究。Te圖顯示，磷酸化蛋白在循環中的停留時間比天然蛋白長。

【結論】

工程化的Adnectin C除了在體外維持其藥理作用外，在穩定性、藥代動力學參數和生物活性方面具有促進磷酸化的作用。然而，需要臨床前的數據來證實磷酸化Adnectin-C優于Adnectin-C。磷酸化可能是延長Adnectin半衰期的一種合適的方法，其特征可與peg酸化相媲美?；谶@些結果，磷酸化Adnectin C可能是一種很有前途的臨床治療藥物